做实验的小伙伴们都知道，与 DNA 相比，RNA 是极其脆弱的。

这是由于 RNA 自身的不稳定性及 RNase 的稳定存在，使得 RNA 极易被分解。

另外，与动物组织和培养细胞相比，植物组织的 RNA 更难提取。它们的细胞壁很难被破坏，并且植物细胞中往往含有大量的化合物，如多糖、酚类以及一些次级代谢产物。

在完整的细胞内，上述物质与核酸是分离的；但在提取过程中细胞破裂，各种物质混杂在一起，容易干扰 RNA 的提取效果。

那么，这些物质是如何影响 RNA 的提取，我们在实验中又该如何去解决呢？下面我们一起来详细聊一聊。
 

 

因素一：基因组 DNA

植物 RNA 提取的过程中，DNA 也会被释放出来，因此基因组 DNA 的去除是影响 RNA 质量的关键因素之一。

在使用琼脂糖凝胶电泳检测 RNA 质量时，若存在 DNA 残留，在 RNA 条带上方、点样孔下方会存在一条带（如图 1 所示）。DNA 残留会对后续实验会造成一定的影响。

 

 

解决方法：

（1）柱提法：减少样本起始投入量，或使用脱氧核糖核酸酶 Ⅰ 进行膜上消化；

（2）细胞/组织总 RNA 提取法（Trizol 法）：向裂解液中加入氯-仿后，需要在低温下高速离心；向裂解液中加入氯-仿后分层，吸取上清时避免吸到中间层和下层；

（3）若后续进行 RT-qPCR 实验，逆转录时可选择含有基因组清除模块的产品。

 

因素二：酚类化合物

很多植物组织特别是植物果实和树木类植物中富含酚类物质，它的含量会随植物的生长而增加，且针叶类植物的酚类物质含量要高于落叶类植物。

纯净的酚为无色，但易氧化为红色至褐色的氧化产物。在提取植物 RNA 进行匀浆时，会产生「褐化效应」，酚类物质会释放出来，氧化后匀浆液变为褐色，并且随着氧化程度的增加而加深。被氧化的酚类化合物可与 RNA 稳定的结合，从而影响 RNA 的分离纯化。
 

解决方法：

（1）选择幼嫩的组织作为实验的材料；

（2）在裂解样品的同时加入合适的抗氧化剂。

 

因素三：多糖物质

多糖是一种高分子聚合物，常见的多糖包括淀粉、纤维素等。植物组织中通常富含多糖，如马铃薯块茎、甘薯等。多糖的许多物理性质和 RNA 相似，因此很难将其与 RNA 分开。同时在沉淀 RNA 时，多糖还会产生胶状沉淀，影响后续的操作。另外，多糖还会抑制后续实验的酶活性。

 

解决方法：

可通过盐酸胍处理去除部分多糖；在高浓度 Na+ 或 K+ 条件下，可通过苯-酚、氯-仿除去部分多糖；此外还可以通过 LiCl 沉淀 RNA，将多糖留在上清。但即使通过这些步骤也还会有很大一部分多糖与 RNA 分离不开，还需要更多有效的解决办法。

 

因素四：蛋白质

蛋白质是影响 RNA 质量的另一重要因素。细胞均含有大量的蛋白质，同时 RNase 也属于蛋白质，因而去除 RNA 中的蛋白质在很大程度上会影响 RNA 的提取效果。

 

解决方法：

（1）冷冻条件下研磨植物材料抑制 RNase 活性；

（2）裂解液中添加合适的蛋白变性剂，如苯-酚、胍、SDS、十六烷基三甲-基溴化铵（CTAB）等；

（3）添加适量蛋白酶 K 以消化蛋白质，再进行进一步的纯化。

 

因素五：次生代谢产物

次生代谢产物在植物对生态环境的适应上有着重要作用，其是细胞生命活动或植物生长发育正常进行的非必需小分子化合物，它的产生和分布通常有种属、器官、组织以及生长发育时期的特异性。

常见的次生代谢产物包括苯丙素类、醌类、黄酮类、单宁类、类萜、生物碱等，这些次级代谢产物容易与 RNA 结合一起被抽提出，从而影响 RNA 的质量。

 

解决方法：

次生代谢产物多种多样，且很多成分尚未完全鉴定，因此还没有非常完整的方法来去除这些代谢产物。目前可以使用选择性沉淀法、氯化铯梯度离心法和 RNA 回收纯化法等来分离纯化植物组织 RNA。

除了关注上面干扰植物 RNA 提取的因素，RNA 提取实验作为各种分子生物学研究实验的基础，在实验操作中，大家往往还会关注的是以下两点：

提取时长：提取大量植物样本时，事半功倍肯定是最理想的效果；

样本兼容性：样本涉及到简单植物、多糖多酚植物时，能做到兼容并包是不二选择。