科研人最怕见到的两种微笑，一个是 ddl 前导师脸上关心的微笑，还有一个是 WB 条带上出现的微笑。
 

 

比如上方右侧图片中的这一个个微笑，看着让人难过。如果你经常出现微笑条带，那么最好在制胶的过程中多点耐心，保证凝固均匀大概率就能避免。除了微笑条带外，WB 的翻车情况还有很多，让人防不胜防，有诗为证：

凝胶不均匀，条带出微笑

抗体有污染，背景有黑斑

装置不合适，内部现气泡

电极不平衡，结果就倾斜

WB 虽基础，细节要注意

作为分子生物学、生物化学和免疫遗传学等研究领域较为基础的实验技术之一的 Western Blot（WB）实验，几乎是每个科研人的入门必备。但 WB 实验耗时长、流程繁杂、操作细节多，任何一点风吹草动都可能会导致结果的变形。我们特意整理了 5 个 Tips，帮你走好 WB 实验的每一步：

 

Tip1

样品制备——低温快速，裂解充分

✦全程在低温环境下完成：样品置于冰上，试剂、离心机预冷等。

✦裂解液的选择：要根据样品类型和下游的定量条件选择合适的裂解液。常用的裂解成分大多包含 Triton X-100、NP-40、十二烷基硫酸钠等，这些成分具有较强的表面活性作用和还原作用，可将细胞膜或核膜裂解，释放其中的物质。

✦蛋白定量：较常用的是 BCA 法，每次检测样品浓度时，均要绘制标准曲线；当样品浓度太高时，需要进行稀释；加样过程中避免产生气泡，防止气泡引起的误差，保持孔间的均一性。

 

Tip2

制胶——胶要均匀，图才好看

✦要根据目的蛋白分子量大小选择合适浓度的分离胶；蛋白分子量越小，需要的分离胶浓度越高；蛋白分子量越大，需要的分离胶浓度越低；

✦ 胶的均匀度直接影响到条带的分离度，胶越均匀，条带越好看；

✦ 灌胶前一定充分混匀且避免气泡产生，玻璃板要干净。

 

Tip3

转膜——浸泡活化，保持湿润

✦ PVDF（聚偏二氟乙.烯）膜较 NC（硝酸纤维素）膜具有更好的蛋白吸附、物理强度以及化学兼容性，推荐 PVDF 膜；

✦ 当目的蛋白分子量 ≤ 20kDa 时，选择 0.22 μm PVDF 膜；当目的蛋白分子量 > 20kDa 时，选择 0.45 μm PVDF 膜；

✦ PVDF 在转膜前先浸泡在甲醇中活化；

✦ 膜在整个实验过程中注意保持湿润，使用镊子夹取，避免手套接触。

 

Tip4

封闭——脱脂奶粉最常用

✦ 转膜结束就要进行封闭，封闭液选择原则就是不与抗体或检测试剂有交叉反应。常见的封闭液是脱脂奶粉、BSA、血清。但是做磷酸化蛋白或某些特殊蛋白时必须使用 BSA 封闭，因为奶粉中含有大量酪氨酸，可使磷酸化蛋白的条带变浅，甚至消失，同时也可能出现较高背景。

 

Tip5

孵育

✦ 抗体稀释时建议参考说明书配比进行稀释，需要先做预实验，找出最佳稀释。