做实验的小伙伴们都知道，与DNA相比，RNA是极其脆弱的。这是由于RNA自身的不稳定性及RNase的稳定存在，极易被分解。一旦降解，后续实验结果往往不如人意。因此，提取RNA后，我们需要对RNA进行相关的质量检测，来确定它是否符合后续的实验要求，如qPCR、Northern分析、cDNA文库构建以及用于微阵列芯片分析的cDNA标记实验等。

 

浓度（纯度）检测

RNA得率有很强的组织特异性，不同组织RNA的丰度和RNA提取的难易程度共同决定了该种组织的RNA得率。那闲话少说，我们来看看下面两种测定RNA浓度的方法。

01、紫外分光光度计

核酸分子的嘌呤和嘧啶碱基，都具有共轭双键，其能吸收紫外光并在260 nm处具有最大吸收峰。大多数蛋白质含有芳香族氨基酸，这些氨基酸在280 nm处有最大吸收峰。另外一些盐离子和有机化合物在230 nm处有吸收峰。

 

根据这些理化性质，可以用紫外分光光度计的方法检测核酸浓度。通常以OD260为1相当于40 ng/μL的单链RNA，因此RNA样品浓度（ng/μL）=OD260×稀释倍数×40 ng/μl。

注意：测量时需先使用溶解RNA的溶液对紫外分光光度计进行校正。

除了RNA浓度，OD260/280和OD260/230还能指示RNA的纯度：

注意：溶液pH值会影响OD值的测量，若用纯水溶解，溶液呈弱酸性，导致OD280上升，OD260/280偏低。

 

02、荧光染料法（Qubit计）

荧光染料可特异的与靶分子（双链DNA、单链DNA、RNA或蛋白）结合，在特定波长光源的激发下发出荧光，仪器接收荧光值转化为浓度值，从而对DNA和RNA进行精准定量。

图2. Qubit检测实验流程

 

03、两种浓度检测方法比较

 

紫外分光光度计和荧光染料法检测各有优势，建议配合使用。紫外分光光度计能指示核酸纯度；荧光染料法特异性及灵敏度更高，适于精确定量的下游实验以及低浓度的珍贵样本，如二代测序等。

完整度检测

 

01、琼脂糖凝胶电泳

我们检测总RNA完整性最常用的方法是采用琼脂糖凝胶电泳。RNA电泳可以在变性和非变性两种情况下进行。在非变性条件下，无法准确判断其分子量；在变性条件下，排除二级结构的影响，RNA的泳动速率与分子量的对数呈线性关系。因此，如需精确测定RNA分子量，需使用变性凝胶，但若为了快速检测RNA完整性，使用普通的琼脂糖凝胶即可。

在看电泳图前，我们需要了解一下沉降系数（S），它是反映生物大分子在离心场中沉降速度的一个指标，值越高，说明分子越大。

图3.RNA质量较好的电泳图示例（肝脏）

那好的电泳图具有哪些特征呢？（如图3）

 

（1）从上到下呈现3条rRNA条带，且上面两条条带明亮、清晰、锐利（指条带的边缘清晰）：

 

★ 一般动物样品有28S、18S、5S——如果提取过程经过过柱处理或者利用CTAB+LiCl方法提取，5S可能较暗或者没有。若是昆虫或软体动物等样本，则只有1条比较明显的带，例如果蝇、牡蛎等。

★ 一般植物样本有三条带：25S、18S、5S；

★ 原核生物一般为：23S、16S、5S；

理论上28S:18S为2.7:1，但长期以来人们使用2:1的比率作为鉴定完整RNA的标准。事实上，大多数样品中提取的RNA几乎都达不到2：1的比值。以DNA Marker做对照（如图3），如果2 kb处的28S和0.9 kb处的18S条带清晰，且28S：18S>1，该完整性可以满足绝大部分实验的要求了。

 

（2）无多余条带。杂带有两种可能：一是存在DNA污染（图4），二是组织部位本身含条带较多（例如含大量叶绿体的样本，如植物叶片等）

 

图4. DNA污染

02、2100检测

Agilent 2100检测可通过芯片实验室微流控技术平台同时对RNA的完整性、纯度或降解程度进行精确的、数字化的评估，可以替代传统的凝胶分析方法。其以峰图和RIN值（RNA Integrity Number）来指示RNA的完整性。

 

▶ 2100峰图：

若核酸完整，则峰图基线平整；若核酸降解严重，则基线不平并出现较多降解峰。

 

▶ RIN值：

数值大小即反映RNA的完整性，在0-10区间范围内，数值越大表明RNA质量越好、完整度越高。且RIN值越大，基线越平整、主峰越锐利。一般认为RIN值≥5，说明RNA完整度较为良好，RIN值≥8，说明RNA完整度较为完美。

 

下图为典型的真核生物2100检测峰图：

图5.真核生物2100峰图（HEK293）

典型真核生物2100峰图中常见有5个峰（图5），但不是所有真核生物都是这几个峰。如植物叶片的细胞器也含有核糖体，在18S前的3个小峰为叶绿体RNA（图6）。

 

图6.水稻叶片峰图